​与猴为伴九年，科学家成功培育出世界首例体细胞克隆猴

与猴为伴九年，科学家成功培育出世界首例体细胞克隆猴

科学家花了整整九年时间，与千只猴子在岛上相伴，成功培育出了世界首个体细胞克隆猴，率先推动了我国发展出基于非人灵长类疾病动物模型的全新医药研究产业链。为什么要做克隆猴？有何意义？在此过程中他们遇见了哪些困难？是如何克服的？

出品："格致论道讲坛"公众号（ID：SELFtalks）

以下内容为中国科学院神经科学研究所研究员孙强演讲实录：

大家好，我是来自中科院神经所的孙强，我今天跟大家分享的是我在科研过程中的一些故事。我的题目叫与猴为伴的这些年。

在讲猴子之前，大家先看一下这些熟悉的动物。这些动物，我们给它统一命名叫实验动物，比如大家都知道的小白鼠。那为什么要做实验动物呢？

举一个简单的例子，我们生病了都会吃药，然而很多药不一定有效，还可能存在安全性的问题、毒性的问题，因此不能用人做实验，要先用实验动物去做筛选工作。通过在它们身上做实验，最后筛选出可以给人用的药。

同时，我们需要把实验动物做得标准化。就像高考，不能一百个考生一百张考卷，我们一定要用同样的“考卷”来考。所以我们希望把实验动物做得标准化，而且还需要这个“考题”有足够的“难度”，能够真正起到考核的作用，所以我们要对动物的基因进行操作。

大家看到这张图上，有小鼠、有大鼠、有羊、有兔子、有狗，还有牛。如果大家了解一点进化论，就知道这些动物的进化关系跟人类相对远一些，我们更希望用什么动物呢？用跟我们进化关系更近的，比如猴子去做实验。

为什么列了这六种动物呢？因为博士毕业以前，这几种动物我都接触过。那我怎么就跟猴子结缘了呢？我是做辅助生殖和生殖技术的，多数人博士毕业以后，都会选择出国留学做博士后，然后发两篇好的paper，再去选一个好的工作。但是有一件事改变了我的选择。

大家可能不认识这只猴子，它叫安迪。2001年的时候，它出生了，这是全球第一个转基因猴，它的诞生意味着人类可以对猴子进行遗传操纵了。也就是说，我们可以把猴子做得比较标准化，成为符合我们要求的特定“考生“的一个“考卷”，比如对特定疾病，我们可以做特定的模型。

这个技术出现后，当时我想，中国（当时）每年出口的猴子量大概3万头，是全球灵长类动物最大的出口国，说不定做猴子是个机会。所以在2004年，博士毕业前，我就选择了这样一个工作——去做猴子（模式猴）。

在讲做猴子之前，先给大家看这张图。这只猴子，它要比安迪年龄大，1984年出生的，它叫皮特瑞，是全球第一个试管猴，通过试管技术做出的猴。当时看到这个信息，心里觉得很不爽，为什么？因为美国人在1983年就做了这只猴（1983年开始做，1984年出生），而我决定做猴子的时候已经是2004年了，20年过去了，我们国家还没有试管猴的技术，我想，有这么难吗？所以我在2005年7月博士毕业以后，没有选择出国，选择了上山。

大家看到图中的这座山，在云南省的西双版纳州，下边这条河叫澜沧江，右边还有一个索道，索道就是上山的通路。我在山上经常一待就是一周，就这样，我在山上待了4年，一直待到2008年。

这是一个973国家重点研发项目，我接手的时候，这个项目已经执行了一半。因为2001年转基因猴技术体系已经建立了，所以项目的目标是希望做出转基因猴。我是半途去的，所以给自己定的目标是至少要做出试管猴，当然了，如果能做出转基因猴更好。

我记得非常清楚，在2007年立春的2月4号这天，我们就做出了中国第一只试管猴，之后又做了十几只猴子，但是很遗憾，没有一只是转基因阳性的。这个项目结束以后，由于没有资金的支持，我就从山上撤回来了。

回来以后，在上海待了半年多。猴子（转基因猴）没有做成功，也没有发出好的文章，也不是海归，工作的提升空间就变小了，所以犹豫了一段时间，甚至开始怀疑当时的选择是不是错了。

但很幸运，一个机会出现了。中国科学院神经所的蒲慕明先生找到我，让我继续做猴子。我很开心，因为我已经跟猴子分开那么久了。蒲先生说在上海重新开始，我说不要在上海重新开始，那太慢了，重新建一个猴子设施需要很长时间，所以我又选择了进岛。

这是苏州的太湖，大家都知道太湖方圆有800里，里边有个西山岛，上面有一个很大的猴场，有1万多只猴子，所以我就又到岛上去陪猴子了。

去太湖跟去西双版纳不同。当时在西双版纳，我带了几个学生去，还有合作方配合。但是太湖，因为我想把它做得更好，就决定自己管所有的事，要自己负责所有的设施。

首先，要在岛上租房。我们先租了一个类似北京四合院的地方（左图），大概有13个房间，然后把我的人带过去，在这里安家。左图中穿黄衣服的是我的管家，穿白衣服的是在西双版纳的时候就跟我一起做试管猴的兽医；右图是当时接近废弃的一个实验室，我们也把它租了下来。开始付不起租金，所以就租了大概100多平的地方。

要做转基因猴，首先要把猴子养好。为什么我们选这里？因为这里有很好的猴子设施。大家看左边的图，有3米的阳光可以射进猴房。因为猴子是社群性动物，它需要阳光照射，才能保证维生素的吸收，它也需要大面积的空间，所以在接近30平米的空间里，我们一般养12到15只猴子。

既要猴子要养好，还要完成实验，我们要做的是辅助生殖实验。猴子的进化跟人很近，比如在生殖内分泌方面，猴子跟人是一样的。特别是母猴，是有月经周期的，月经周期平均28天，有卵泡生长、排卵和黄体期，而且也是单胎生殖。

我们做辅助生殖实验，是希望拿到更多的卵母细胞，因此就要让猴子超数排卵。超数排卵显然不能在黄体期，黄体期给药的话，卵是排不出来的，必须在卵泡生长期，也就是它月经来了以后，开始给它注射激素，然后到要排卵的时候，看见它排卵，再把卵取出来。

那么就有一个问题，我需要知道每只猴子的月经周期，如果不知道的话，就没办法得到卵。猴子不会告诉我们什么时候来月经，也不能去蒙，这就需要去看、去观察。

如果把猴子养到这样一个笼子里，我们做事就很舒服了。这个笼子有个拉杆，一拉就能把猴子拉过来，这样就看得很容易。但是刚才讲了，猴子是社群动物，这样猴子会不满意，它会抑郁，健康状态也下降。那怎么办呢？

在西双版纳山上的4年期间，我就思考过这个问题。在西双版纳我换了3批猴子，每批大概做半年左右就不行了，厂家很负责地给我换。但是我的资金有限，我必须把每个猴子都用好。我们知道猴子很聪明，所以我就要求我的兽医要跟它做朋友。当然了，不是简单做朋友，而是要跟猴子长时间待在一起，教会它做事。

这里有个视频，就是我们怎么看猴子的月经。这是2011年来到我这里工作的兽医，叫聂艳红。她来的时候还是实习，在这个猴房待了三年以后，她就可以很容易地让这十几只猴子听她的话。

比如要看猴子的月经，她给猴子一个指令，好多猴子就会停在那里，让她去做这件事，这样就解决了大问题。现在我们岛上a大概有1000多只猴子，每年看猴子的月经累计要看5万多次。

我们还要给猴子打针，就是给它注入激素，也要在这里完成。不能把它放单笼里，因为它的健康状态会下降。另外猴子平时会生病，比如腹泻、肺炎或者咬伤，我们都要处理，熟悉以后其实也很easy。

这是我的另一个兽医。这只猴子生病了，兽医要去给它打一针，不用去追它，只要给它一些指令，它就停在这里了。每次猴子超排，从月经来的第一天开始，一般要打12天，一天打2针。

就这样，我们养好了猴子。动物好是基础，基础好了，我们还要做事，做事得先搭台子。

我们租的是废旧设施，留下好多猴笼，为了节约资金，我就继续用旧的猴笼。但是有些猴子不老实，比如一些怀孕的猴子，它们有时候会把笼子给拆掉。笼子坏掉了，猴子就跑掉了，这是很麻烦的事情。

如果让厂家来帮忙维修，厂家经常反应很慢，要等两三个月。所以后来我就招了一个会做电焊的小伙子，给他买了电焊机，一旦有问题他就可以马上处理。不但如此，我们的实验室也是自己装修粉刷的，车篷也是我们自己修的，大家都以我们的平台为家，自己弄。

平台搭建好了，就要做出真正的模型，给药物研发出“考卷”。举一个例子，实验期间我们做了这样一个模型：把一个孤独症相关的基因转到猴子里，结果发现部分猴子出现了这种情况：猴子总是绕一个方向这样转来转去，就像图中显示的这样。

我们知道患有孤独症的小孩会有刻板行为和社交障碍，猴子也是一样。把两个猴子放在一起， 正常的猴子会很开心，它们会聊聊天或者做个游戏。但是把我们这两个转基因猴放在一起，它们互相不理睬，都躲到角落里。

这项工作我们2011年就做出来了，经过一系列的行为学表型分析，得到了它的F1代。《自然》杂志接受了我们的文章，这项工作也获得了2016年中国的十大科学进展奖。

我们还做了很多其他动物模型，但是发现了一些问题：用前面的方法做的猴子，由于基因型不一致，不能做复杂操作。假设猴子是一张“考卷”，我不能在它身上出很复杂的题，比如同时改变好几个基因，改变3个或4个基因，这点做不到，因为在胚胎学上效率低，而且猴子的遗传背景也不一致。

如果大家有一点生物学背景的话，就知道小白鼠是可以通过连续20代近交，得到近交系，近交以后遗传背景是一致的。小鼠的繁殖周期大概是半年，连续20代也就顶多10年时间，而且这件事在上个世纪初就做完了。但猴子的繁殖周期、性成熟时间、传代时间要5年，做20代就要100年，我相信这样做的话，没人能做得成。

所以，我虽然能出“考卷”，但是这个“考卷”并不能真正把我想要的东西“考”出来，也就是说这个“考卷”出得太简单了，不能做成模型。那么，有没有办法能做成模型呢？有，就是通过克隆。

我给大家介绍一下克隆的过程。大家看上面这张图，我们先从红色的猴A取出体细胞，再从蓝色的猴B取出卵母细胞，然后把卵母细胞的核去掉，核是遗传物质，把遗传物质拿掉，把体细胞跟卵母细胞放到一起，然后把它激活，变成一个胚胎，移到橙色的猴C，最后生出一只猴子，它就是猴A的克隆。

1997年第一个克隆哺乳动物的“报道”，就是克隆羊多莉。那为什么克隆可以解决上述问题？因为通过克隆我可以在体细胞上做遗传操作，细胞可以在体外无限增值，我可以拿到106、107……很多很多的细胞。

我们对来自猴A的体细胞进行体外基因编辑，成为单个细胞，拿这个细胞再去克隆的话，生出的猴子就带有这个基因。

最关键的一点，刚才说了，猴子有一个大问题，就是它的传代时间在5年以上。比如我出一张“考卷”想快速“复印”给很多人去用，给药厂做药物筛选，可以用猴子做模型，但是要等五年才能把这猴子“复印”出来，这样的效率，做生物学是等不起的。

那有没有快速“复印”的办法？我们知道猴子的怀孕期是160天，也就是说160天我能拿到一个带有遗传操纵的克隆猴。如果连续做，一年内我就有可能拿到很多这样的克隆猴，而且这些猴子的遗传背景是一致的，都来自这个体细胞的猴A，它的基因型也是一致的。

这样就完全解决了我前面说的那些问题，这个“考卷”是好用的，而且能够快速拿到很多“考卷”去给大家用。但是这件事要做成，首先就是要能做克隆猴，做克隆猴有点难。

1997年克隆羊多莉诞生后，有二十几种哺乳动物都克隆出来了，大家会想，那猴子有没有人在做？其实2002年就有人做，到2003年的时候，美国匹兹堡大学的杰瑞·沙腾教授也费了很大劲儿在做这件事。美国有八大灵长类中心是国家支持的，其中最早的灵长类中心叫俄勒冈灵长类中心，大概有7000多只猴子在那里存着。杰瑞·沙腾教授依靠着灵长类中心，曾经一次性做了700多个卵，然后移植到30多个猴子体内，最后都没生，他当时很失望。

于是杰瑞·沙腾教授得出一个结论，就是用现有的方法做不出体细胞克隆猴。为什么？大家看上图，图B是细胞分裂的时候形成的一个好的纺锤体。杰瑞·沙腾教授发现，克隆猴的胚胎在做核移植的时候，会把形成纺锤体的关键蛋白去掉，导致纺锤体不能成形，细胞就不能正常分裂，这样胚胎也不能发育，所以他觉得肯定做不成了，他把相关paper也发到《Science》了。

之后，俄勒冈灵长类中心的另一位教授——米塔利波夫，他不服，他觉得这可能是技术问题，要去解决。所以他一直坚持在做，发了很多文章。2007年的时候，他接受一个杂志的采访，说他已经用了15000枚卵来做这个猴子。到2010年的时候，他发了一篇paper，就是把克隆胚胎移到10个猴子体内，但是只有1只怀孕，但是怀孕到81天，这个猴子流产了。

我刚才说了，猴子怀孕期是160天，81天代表什么？代表路程已经走了一半。2012年我们启动这个项目时，蒲先生对我说：“米塔利波夫已经把这条路的前一半走完了，我们要把后一半走过去。”但是后一半有点难，最关键的是要能解决猴模式动物构建中的一些问题。

我们知道小鼠多胎生，卵母细胞资源无限，因为小鼠好养，而且繁殖快。那家畜呢？家畜是我们的食物，它的卵巢就是我们吃肉的副产品，所以卵母细胞资源也很丰富。但是，我们知道猴子有月经，它不像小鼠繁殖那么快，它的卵母细胞资源有限，所以我们不能去赌。

米塔利波夫用了15000枚卵都做不出来，15000枚是什么概念呢？2012年项目启动的时候，我们大概有300多只猴子，都是可以超排的，把所有的猴子的所有周期都用上，都拿不到15000枚卵。所以我们要一步步地解决问题。

我们总共用了接近五年时间去解决这些问题，前边都是失败、失败、失败，最大的失败出现在2017年的8月。大家可能知道，2017年年底的时候，我们的克隆猴中中、华华诞生了。其实在2017年8月的时候，我们就得到了两只克隆猴，一只在140多天的时候生出来，活了三个小时，没有肺呼吸，死掉了；另一只活了30个小时也死掉了。

那个时候我们的失望达到了极点，就像买彩票，彩票中奖号码是10个，第1个号码到第9个号码都是对的，然后到第10个号码突然错了。这种感觉让人很失落。当时我们团队只有三个人，就是管细胞的管家、第一作者刘真和我。太湖很大，我就带他们到湖边转一转，散散心。

我跟他们说，我们要从失败中走出来，我们已经有很大的进步了，因为猴子已经到full-term（足月）了，不像米塔利波夫的只是一个流产的组织，我相信我们一定能做出来。2017年年底，我们终于成功做出了克隆猴。

我必须要介绍一下我们的兽医团队。大家知道，人类和猴子在进化上的共同的祖先曾经生活在大草原上，而大草原上有很多猴子的天敌，所以猴子在生产的时候，都选择后半夜，因为这样在进化上会有优势。如果它选择白天生产，很可能被敌人、捕食者发现。

克隆猴也是这样，经常在后半夜生产，而且克隆猴经常会难产。那怎么办？猴子快临产的时候，它也不会告诉我们。没办法，我们就只能发挥人力——兽医进行监控。

在猴子临产前的一个月，也就是130天左右的时候，我们把它放到红外摄像机下，让我们的兽医24小时去看是否有临产症状，一旦有临产症状，就打电话给主兽医，给猴子做助产或者剖腹产。

所以我要求我的兽医电话不能断电，不能静音，还要24小时开机。猴子很有脾气，它经常后半夜响，所以兽医经常半夜起来。因为经常这样半夜爬起来，所以有一天我们的兽医发了个状态，说半夜的电话铃声像一声惊雷，他怀疑自己得了职业病。

但是这份工作是值得的。2017年11月27日，我们的第一只克隆猴，中中，在凌晨3点钟剖腹产生出来了。12月5日第二只克隆猴，华华，在半夜11点多剖腹产生出来了。上面这个照片就是中中和华华。

这里有个视频，是2018年五月底，克隆猴中中华华半岁的时候拍的，它们刚刚断奶。我们把它们跟两只普通的食蟹猴放到一起群养。

从毛色上看，两个毛色有点泛黄的是克隆猴。但从外表很难分清哪个是中中，哪个是华华，我也要根据它们的行为状态来区分。大家看视频，中中喜欢做一个动作，就是抱着它的小伙伴，而且它非常喜欢做这个动作，这是它的标志性动作。

真的很幸运，我们团队经过努力，终于把克隆猴突破了，但我觉得这只是个新起点，我们希望在这个基础上能做更好的模式动物。

最后，我要首先感谢蒲先生，当我在西双版纳做猴子做不下去的时候，他给了我一次机会，并且在这九年一直支持我。也感谢我团队的核心刘真，他在博士毕业的时候发了《Nature》文章，本可以去找更好的工作，但他继续在我这里坚守。还有我的管家蔡毅君，包括刚才我说的得了职业病的兽医，以及我的团队。

我还要感谢一下我的家人，因为这些年跟猴子在一起的时间，比跟他们在一起的时间都多。谢谢大家。

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